Studie Optimale Raumluftfeuchte

Kurzzusammenfassung



Studienbeschreibung / Versuchsaufbau
Ziel dieser Studie war es, den Zusammenhang zwischen der Luftfeuchtigkeit und der Lebensfähigkeit des Influenza-A-Virus (IAV) während der Übertragung zwischen den Wirten zu bestimmen und die zugrundeliegenden Mechanismen zu erklären.

Die Autoren haben die Lebensfähigkeit (Überlebensrate) von IAV in Tröpfchen gemessen, die aus verschiedenen Lösungen bestehen. Die verschiedenen Lösungen wurden ausgewählt, um die Wirkungen der Salze und Proteine, die in der Atemflüssigkeit und im menschlichen Schleim gefunden werden, auf das Virus bei relativen Feuchtigkeitsgehalten im Bereich von 17% bis 100% relativer Feuchtigkeit (% r. F.) zu isolieren. Das Grippevirus wurde in Tröpfchen von zwei Salz enthaltenden Lösungen (PBS und DMEM), identischen Lösungen, die mit Proteinen (FCS) angereichert waren, und in dem sterilisierten menschlichen Schleim eines einmonatigen Babys suspendiert. In einem Exsikkator wurden die Tröpfchen bei Raumtemperatur (20 bis 24°C) verschiedenen Bereichen relativer Feuchtigkeit (r. F.) zwischen weniger als 17,5% und 99,1% r. F. ausgesetzt.

Ergebnisse

Virus, das Tröpfchen aller Lösungen enthielt, kristallisierte bei Werten relativer Feuchtigkeit von knapp unter 50%. In ausgetrockneten Tröpfchen scheinen Viren geschützt zu sein und lebensfähig zu bleiben (siehe Abb. A, B und C). In reinen Salz- und kombinierten Salz-/Protein-Suspensionen war die Lebensfähigkeit am geringsten oberhalb von 50% r. F., bevor eine Austrocknung auftrat. Proteine erhöhen die Lebensfähigkeit in Suspensionen (Abb. B) wahrscheinlich durch Verringerung der schädlichen Wirkung der hohen Salzkonzentration. In der Schleimhaut war die Lebensfähigkeit 10 bis 500 Mal niedriger als in anderen Medien, am niedrigsten war die Lebensfähigkeit oberhalb von 80% relativer Feuchte.

Die Ergebnisse liefern wertvolle Erklärungen für die Grippesaisonalität. In gemäßigten Klimazonen erhöht niedrige Luftfeuchtigkeit in Innenräumen das Virusüberleben durch Kristallisation von Salzen in luftgetragenen Tröpfchen und verlängert die Flugzeit für infektiöse Tröpfchen aufgrund einer verringerten Tröpfchengröße durch Verdampfung. In tropischen Regionen können hohe Temperaturen die Übertragung insbesondere durch den Aerosolweg unterdrücken. Niedrigere Temperaturen und nahezu gesättigte relative Luftfeuchtigkeit während der Regenzeit bieten jedoch die Möglichkeit, große Tröpfchen und sehr kleine Aerosole über verschiedene Mechanismen zu übertragen.

Große Tropfen würden sich aufgrund der Gravitation schneller absetzen, da sie bei einer ungefähren relativen Feuchte von 100% nicht so stark schrumpfen. Sobald sie sich auf einer Oberfläche abgelagert haben, können sie als ein Reservoir für die Kontaktübertragung dienen, da IAV, wie in dieser Studie gezeigt, bei ca. 100% r. F. gut konserviert ist. Auf der anderen Seite würden Submikron-Aerosole, wie jene, die im menschlichen Atem ausgeatmet werden, in der Luft bleiben, und dank der niedrigeren Temperaturen und geeigneter relativer Luftfeuchtigkeit für das Überleben des Virus, könnte die Übertragung durch diese Submikron-Tröpfchen über den Aerosolweg noch wirksam sein.



Studie von Wan Yang



Die Luftfeuchtigkeit wurde mit der saisonalen Influenza in Verbindung gebracht. Jedoch bleiben die Mechanismen, die dieser Beziehung zugrunde liegen, unklar. Es gibt keine konsistente Erklärung für die Übertragungsmuster der Influenza, die sowohl für gemäßigte als auch für tropische Regionen gilt. Ziel dieser Studie war es, den Zusammenhang zwischen der Luftfeuchtigkeit und der Lebensfähigkeit des Influenza-A-Virus (IAV) während der Übertragung zwischen den Wirten zu bestimmen und die zugrundeliegenden Mechanismen zu erklären. Wir haben die Lebensfähigkeit von IAV in Tröpfchen gemessen, die aus verschiedenen Modellmedien bestehen, die ausgewählt wurden, um die Wirkungen von Salzen und Proteinen in der Atemflüssigkeit und im menschlichen Schleim bei relativen Feuchtigkeiten (r. F.) im Bereich von 17% bis 100% zu isolieren. In allen Medien und Schleim war die Lebensfähigkeit am höchsten, wenn die relative Feuchtigkeit entweder nahe bei 100% oder unter 50% lag.

Wenn die relative Feuchtigkeit von 84% auf 50% abnahm, hing die Beziehung zwischen Lebensfähigkeit und relativer Feuchter von der Zusammensetzung der Tröpfchen ab: Die Lebensfähigkeit nahm in Kochsalzlösungen ab, änderte sich in mit Proteinen angereicherten Lösungen nicht wesentlich und nahm im Schleim dramatisch zu. Zusätzlich stieg der Viruszerfall linear mit der Salzkonzentration in Salzlösungen an, jedoch nicht, wenn sie mit Proteinen ergänzt wurden. Es scheint drei Regime der Lebensfähigkeit der IAV in Tröpfchen zu geben, definiert durch Feuchtigkeit: physiologische Bedingungen (100% r. F.) mit hoher Lebensfähigkeit, konzentrierte Bedingungen (50% bis nahe 100% r. F.) mit geringerer Lebensfähigkeit in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Medien und trockene Bedingungen (50% r. F.) mit hoher Lebensfähigkeit. Dieses Paradigma könnte dazu beitragen, widersprüchliche Ergebnisse in der Literatur über die Beziehung zwischen der Lebensfähigkeit der IAV in Aerosolen und Feuchtigkeit aufzulösen, und Ergebnisse in menschlichem Schleim könnten dazu beitragen, die Saisonalität von Influenza in verschiedenen Regionen zu erklären.

Einführung

Influenza hat auf der ganzen Welt unterschiedliche Übertragungsmuster. In gemäßigten Regionen liegt die Inzidenz der Influenza im Winter [1,2], während in einigen tropischen Regionen das Auftreten der Krankheit mit der Regenzeit übereinstimmt [3-5]. Diese Muster haben ein starkes Interesse daran ausgelöst, die Mechanismen, die hinter ihnen stehen, zu enthüllen. Eine konsistente Erklärung fehlt jedoch trotz fast eines Jahrhunderts der Untersuchung [6,7]. Die Feuchtigkeit wurde als ein Faktor identifiziert, der die Saisonalität der Influenza beeinflusst [8,9]. Frühere Studien haben die hohe Inzidenz von Influenza in gemäßigten Regionen mit niedriger Luft-feuchtigkeit im Winter in Verbindung gebracht [10-12]. Dieser Zusammenhang wird durch Laborstudien gestützt, die darauf hinweisen, dass das Influenza A-Virus (IAV) bei niedriger relativer Feuchtigkeit (r. F.) besser überlebt [8,13-15].

Dennoch bleiben einige wichtige Fragen offen. Erstens kann der Zusammenhang zwischen hoher Influenza-Inzidenz und niedriger Luftfeuchtigkeit die erhöhte Influenza-Aktivität in einigen tropischen Gebieten während der Regenzeit nicht erklären, wenn die Luftfeuchtigkeit maximal ist. Zweitens waren die Ergebnisse bei mittlerer bis hoher (50% bis 90%) relativer Feuchte diskordant [7], obwohl Laborstudien übereinstimmend eine hohe Überlebensrate für IAV bei niedriger relativer Feuchte (50%) zeigten. Von den vier am häufigsten zitierten Studien haben Hemmes et al. [8] und Harper [13] (im Folgenden als H & H bezeichnet) sowohl bei mittlerer als auch bei hoher relativer Luftfeuchtigkeit höhere Inaktivierungsraten gefunden, während Shechmeister [15] und Schaffer et al. [14] (im Folgenden als S & S bezeichnet) über die höchsten Inaktivierungsraten bei mittlerer relativer Luftfeuchtigkeit und moderate bei hoher relativer Luftfeuchtigkeit berichteten. Die Beziehung zwischen der Lebensfähigkeit von IAV in Tröpfchen in der Luft und der relativen Luftfeuchtigkeit in der Umgebung bleibt schlecht definiert und schlecht verstanden.

Eine weitere unbeantwortete Frage betrifft den Mechanismus, durch den die Luftfeuchtigkeit die IAV in luftgetragenen Atemtröpfchen beeinflussen könnte [9]. Nach Freisetzung aus dem Respirationstrakt, wo die relative Luftfeuchtigkeit ungefähr 100% beträgt, schrumpft ein Atemtröpfchen um 40 bis 50% im Durchmesser bei einer relativen Feuchtigkeit unter 90% aufgrund der Verdunstung [16-18]. Als ein Ergebnis erhöhen sich die Konzentrationen von gelösten Stoffen in dem Tröpfchen um bis zu 15-mal und gelöste Stoffe wie Salze (z. B. Natriumchlorid (NaCl)), die in physiologischen Konzentrationen unschädlich sind, können für das Virus schädlich werden. Zum Beispiel wurde berichtet, dass Vogel-IAV bei Salinitäten von mehr als 25 g/L weniger stabil ist [19]. Die Verdunstung führt zu Veränderungen der Mikroumgebung von IAV in Tröpfchen, die die Lebensfähigkeit des Virus beeinträchtigen können; die toxische Wirkung von gelösten Stoffen kann bei niedrigerer relativer Luftfeuchtigkeit aufgrund höherer Konzentrationen, die aus einem größeren Wasserverlust resultieren, verstärkt werden. Atemtröpfchen enthalten jedoch auch eine Vielzahl von Proteinen [20,21], und ihre Wechselwirkungen mit Salzen bei unterschiedlichen relativen Luftfeuchtigkeit können dieses Bild unter natürlichen Bedingungen erschweren. Wir nehmen an, dass die Luftfeuchtigkeit das Überleben von IAV in einem Tröpfchen beeinflusst, indem das Ausmaß der Verdampfung und damit die Konzentrationen gelöster Stoffe im Tröpfchen gesteuert werden und dass die Konzentrationen gelöster Stoffe im Tröpfchen die Beziehung zwischen der relativen Luftfeuchtigkeit und der Lebensfähigkeit des IAV definieren.

Wir entwickelten ein einfaches Experiment, um die Auswirkungen von Salzen und Proteinen auf die Lebensfähigkeit von IAV zu testen und zum ersten Mal dessen Beziehung zur relativen Luftfeuchtigkeit im menschlichen Schleim zu bestimmen. Unsere Ergebnisse lösen die oben genannte Diskrepanz in der Literatur. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse schlagen wir eine mechanistische Erklärung für die Abhängigkeit des IAV-Überlebens von der Feuchte und den Influenza-Übertragungsmustern in gemäßigten und tropischen Regionen vor.

Materialen und Methoden

Ethik-Erklärung
Die Sammlung und Verwendung von menschlichem Schleim wurde vom Institutional Review Board der Virginia Tech genehmigt. Die Ethikkommission benötigte keine Zustimmung für dieses Protokoll.

Zellen und Virus
Madin-Darby-Eckzahnnieren-(MDCK)-Zellen wurden in Dulbecco‘s modifiziertem Adler-Medium (DMEM), ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum (FCS), gehalten. Der Bestand der IAV A / PR / 8/34 (H1N1) wurde mit einem plaquegereinigten Stamm [22] in zehn Tage alten spezifischen pathogenfreien embryonierten Hühnereiern hergestellt. Die Virusvorräte wurden als Aliquots von Allantoisflüssigkeit aus infizierten Embryonen bei 280°C bis zur Verwendung gelagert. Der Titer des Virusstocks wurde zu 1,786108 ml (TCID50) im Median der infektiösen Gewebekultur bestimmt21. Alle Virustitrationsexperimente wurden in MDCK-Zellen durchgeführt.

Schleimprobe
Eine Schleimprobe wurde von einem Säugling im Alter von einem Monat im März 2011 gesammelt. Die Schleimprobe wurde in einem Fläschchen getrocknet und durch Auflösung in MilliQ Wasser (5% w/v). Um die Schleimstruktur zu erhalten, versuchten wir zuerst, die Schleimprobe zu sterilisieren, indem wir sie durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 mm führten. Die Probe war nicht fil-trierbar, was auf ihre große Molekülgröße hinweist. Somit wurde der rekonstruierte Schleim durch Erwärmen bei 65 ° C für 30 Minuten sterilisiert und auf eine potentielle IAV-Kontamination durch den TCID50-Test überprüft. Kein IAV wurde nachgewiesen und die Probe wurde bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.

Kontrolle der relativen Luftfeuchte in einem Exsikkator

Zwei Petrischalen, die mit 20 ml Salzlösung (entweder Kaliumacetat, Kaliumcarbonat, Kobalt (II) -chlorid oder Kaliumchlorid) oder doppelt destilliertem Wasser gefüllt waren, wurden in einen Exsikkator [23, 24] gegeben. Die Luftzirkulation innerhalb des Exsikkators wurde durch einen Ventilator verbessert, um die Herstellung einer Gleichgewichts-Luftfeuchte zwischen der Salzlösung und der Luft innerhalb des Exsikkators zu beschleunigen. Bevor jedes Experiment begann, wurde der Exsikkator auf die gewünschte relative Feuchte konditioniert. Der Exsikkator musste kurz geöffnet werden, um die Proben einzufügen, und das System stellte das Gleichgewicht innerhalb von zehn Minuten wieder her. Die tatsächliche r. F. und die Temperatur innerhalb des Exsikkators wurden während der Probenahme mit einem Temperatur-/Feuchtigkeitslogger (OM-73, Omega Engineering, Inc., USA) in Intervallen von einer Minute aufgezeichnet. In Modellmedien getestete relative Feuchten umfassten 17,5±1,0%, 27,6±0,9%, 42,0±0,8%, 44,1±1,2%, 50,2±0,7%, 59,5±1,1%, 76,1±0,7%, 84,1±0,8% und 98,9±0,4%. In Schleimproben getestete relative Feuchten enthielten 26,7±0,8%, 40,3±1,1%, 48,0±1,2%, 52,0±0,9%, 60,8±1,1%, 72,2±1,2%, 83,9±0,4% und 99,1±0,4%.

Exposition von IAV in Tröpfchen gegenüber verschiedenen relativen Feuchten
Wir haben IAV in Tröpfchen bei Raumtemperatur (20-24°C) spezifischen relativen Luftfeuchten im Bereich von 17% bis 100% ausgesetzt. Die Tröpfchen bestanden aus vier verschiedenen Arten von Medien, die ausgewählt wurden, um die Auswirkungen von Salzen und/oder Proteinen auf die Lebensfähigkeit oder auf den Schleim zu isolieren. PBS und DMEM wurden als Ersatz für Medien verwendet, die anorganische Salze in physiologischen Mengen, aber keine oder vernachlässigbare Mengen an Proteinen enthielten. Der dritte und vierte Medientyp waren PBS und DMEM, die mit 5% FCS, einer Proteinquelle, supplementiert waren. 10 μL PR / 8 IAV-Stammlösung wurden zu 90 μL entweder PBS, PBS + 5% FCS, DMEM, DMEM + 5% FCS oder Schleim gegeben, um Dotierungslösungen herzustellen. Die Dotierungslösungen wurden auf eine Zellkulturplatte mit 12 Vertiefungen, 1 μL pro Tröpfchen, 10 Tröpfchen pro Vertiefung und 3 Wiederholungen (d. H. 3 Vertiefungen) für jedes Medium verteilt.

Die Platte wurde sofort in den Exsikkator gegeben und bei einer spezifischen r. F. bei Raumtemperatur für drei Stunden für Modellmedien und zwei Stunden für Schleim inkubiert. Am Ende des Zeitraums wurde das Virus in jeder Vertiefung mit 1 μL DMEM, ergänzt mit 1 μg/L TPCK-Trypsin (Sammelmedium), durch 10-maliges Pipettieren des Mediums gesammelt, um das Virus aus dem Loch zu spülen. Die Dotierungslösungen wurden während der Inkubationszeit auf Eis gelagert und 10 μL jeder Dotierungslösung wurden mit 990 μL Sammlungsmedium zur Verwendung als Kontrolle ergänzt. Die Proben und die entsprechenden Kontrollen wurden zur gleichen Zeit durch TCID50-Assay entweder unmittelbar nach der Entnahme titriert oder bis zum Test bei -80°C gelagert. Medien, die in Studien zur Lebensfähigkeit von Influenza A-Viren im Vergleich zu RH verwendet wurden.

Beobachtung der Transformation von Tröpfchen unter variierenden relativen Feuchtewerten
Tröpfchen von PBS, PBS + 5% FCS, DMEM oder DMEM + 5% FCS (alle ohne Zugabe von IAV) in 1- μL-Volumina wurden auf einer 12-Loch-Zellkulturplatte verteilt und, wie oben beschrieben, unter verschiedenen relativen Feuchtewerten inkubiert. Platten wurden aus dem Inkubator genommen und sofort unter einem inversen Lichtmikroskop (100X) beobachtet.

Fotos wurden von einer Kamera aufgenommen, die mit dem Mikroskop verbunden war. Um die Zeit zu bestimmen, die ein Tröpfchen von 1 μL zum Austrocknen benötigt, wurden Tröpfchen von PBS, PBS + 5% FCS, DMEM oder DMEM + 5% FCS auf einem Glasobjektträger unter dem Mikroskop verteilt und kontinuierlich beobachtet bis der Tropfen kristallisierte. Die Umgebungs-Luftfeuchte betrug 49,4±0,2% im Mikroskopraum.

Berechnung der viralen Zerfallsrate
Die prozentuale Lebensfähigkeit wurde berechnet als Lebensfähigkeit = Nt/N0 x 100%, wobei Nt und N0 jeweils die End- und Anfangstiter des Virus sind.
Die logarithmische Abklingrate wurde berechnet als log decay = log10(Nt/N0). Nt wurde für negative Abtastwerte auf 1 gesetzt, um eine Division durch 0 zu vermeiden.

Abschätzung der Konzentration von gelösten Stoffen im Gleichgewicht
Die Molalität von NaCl in dem resultierenden Tröpfchen bei einer spezifischen RH wurde unter Verwendung des Microsoft-Löser-Tools gemäß einer empirischen Beziehung berechnet [25]:

wobei m die Molalität von NaCl (Mol (kg Wasser) -1) ist. Die Konzentration von NaCl wurde dann basierend auf m berechnet:


Cs = mMs/mvs + 1

wo Cs die Konzentration des gelösten Stoffes im Gleichgewicht ist; Ms ist das Molekulargewicht von NaCl (58,44 g mol - 1); vs ist das molare Volumen von NaCl (2,761022 L mol - 1); und die Zahl 1 im Nenner repräsentiert das Volumen von 1 kg Wasser, d. h. 1 L.

Abbildung 1. Beziehung zwischen relativer Luftfeuchtigkeit und Lebensfähigkeit des IAV in (A) Medien mit hauptsächlich Salzen,
(B) Medien mit Salzen plus Proteinen und (C) Schleim. Fehlerbalken kennzeichnen Standardabweichungen.
Abbildung 2. Viruszerfall über 3 Stunden gegenüber der NaCl-Konzentration in Tröpfchen,
die aus vier Medientypen bestehen.
Ergebnisse
IAV-Lebensfähigkeit in Model Media gegenüber relativer Feuchte

Wie in Abbildung 1A und 1B gezeigt, waren die IAV-Lebensfähigkeiten in vier Modellmedien, die verschiedene Kombinationen von Salzen und Proteinen enthielten, bei extrem hoher (ca. 100%) und niedriger (< 50%) r. F. und minimal bei mittlerer (50 bis 84%) r. F. am höchsten. Bei 100% r. F. lagen die Lebensfähigkeiten im Bereich von 8% bis 57%, nämlich 36±15% in PBS, 7,8±0, 27% in DMEM, 11±4,1% in PBS + FCS und 57±11% in DMEM + FCS des eingeführten Virus. Bei 84% r. F. waren die Lebensfähigkeiten viel niedriger (1-5%), lagen jedoch in allen vier Medien in der gleichen Größenordnung.

Bei einer relativen Luftfeuchtigkeit zwischen 50% und 84% divergierten die Trends in der Lebensfähigkeit dramatisch, abhängig davon, ob die Medien Proteine enthielten oder nicht. Die Lebensfähigkeit in PBS nahm mit abnehmender r. F. ab und erreichte ein Minimum bei 50% relativer Feuchte. In DMEM war der Trend ähnlich, aber das Minimum trat bei einer Feuchte von 60% auf (Abb. 1A).

Im Gegensatz dazu änderten sich die Lebensfähigkeiten in PBS + FCS über diesen Feuchte-Bereich nicht signifikant und in DMEM + FCS nahmen die Lebensfähigkeiten mit abnehmender r. F. leicht zu (Abb. 1B). Bei relativen Feuchten unter 50% waren die Lebensfähigkeiten in allen Arten von Medien höher als in denen mit mittlerer r. F., obwohl die Lebensfähigkeit in PBS allein signifikant geringer war als in den drei anderen Medien, möglicherweise aufgrund des Fehlens von Proteinen.

Wir wiederholten das Experiment, um diese Ergebnisse zu bestätigen. Die wiedergewonnenen prozentualen Viabilitäten variierten leicht, aber die Trends in Rentabilität gegenüber r. F. waren ähnlich.

IAV Lebensfähigkeit im Schleim gegenüber relativer Luftfeuchtigkeit
Wir testeten die Veränderungen in der Lebensfähigkeit von IAV, die in menschlichen Schleim bei RH-Werten von 26 bis 100% eingedrungen sind. Wie in Fig. 1C gezeigt, betrug bei 100% r. F. die Lebensfähigkeit von IAV nur 1,7±0,26%, eine Größenordnung niedriger als in Modellmedien. Die Feststellung, dass die Lebensfähigkeit bei dieser extrem hohen r. F. am höchsten war, stimmte mit Ergebnissen in anderen Medien überein. Bei einer relativen Luftfeuchtigkeit zwischen 50% und 84% nahm die Lebensfähigkeit mit abnehmender r. F. dramatisch zu. Nur 0,0027±0,0023% wurden bei 84% relativer Feuchtigkeit zurückgewonnen, verglichen mit 1,5±1,4%, die bei 48% relativer Feuchtigkeit gewonnen wurden, eine Abnahme von mehr als zwei Größenordnungen. Bei r. F. unter 48% haben sich die Bewohnbarkeiten eingependelt und bliben bei rund 1%. Wir wiederholten das Experiment bei vier (27%, 60%, 84% und 99%) der sechs relativen Feuchtigkeiten und die resultierenden Lebensfähigkeiten folgten demselben Trend wie in Abb. 1C gezeigt. Mit Spike-Titern von 5.1±2.6x104 TCID50 wurde kein lebensfähiges IAV in 5 von 9 Proben bei 84% r. F. nachgewiesen.

Beziehung zwischen Virusverfall und Salzkonzentrationen
Die Beziehung zwischen den Zerfallsraten der Viren und den Salzkonzentrationen in den Tröpfchen ist in Abb. 2 gezeigt. Die vier in dieser Studie verwendeten Medien und die Schleimprobe enthielten mehrere Arten von Salzen. Da NaCl jedoch das Hauptsalz in allen Medien und im Schleim war, schätzten wir die Gesamtkonzentrationen der Salze in den Tröpfchen im Gleichgewicht als äquivalente Mengen an NaCl; Konzentrationen wurden empirisch geschätzt [25]. Die Konzentration von NaCl in einem Tröpfchen ist mit r. F. verbunden; Wie jedoch durch die Polynomfunktion in Gl. 3 ist die Korrelation nicht einfach linear.

Die Virusabbaurate in PBS-Tröpfchen steigt linear mit der NaCl-Konzentration im Bereich von 25-510 g/L an, entsprechend 99-50% r. F. (R2 = 0,97). Die Konzentrationen sind bei hoher relativer Feuchte geringer, da die Verdampfung geringer ist und umgekehrt. In ähnlicher Weise steigt die Virusab-baurate in DMEM-Tröpfchen auch linear mit der NaCl- Konzentration bis zu 420 g/L an, entsprechend 60% r. F. (R2 = 0,98). Im Gegensatz dazu bleiben die Viruszerfallsraten in Medien, die FCS enthalten, unabhängig von der NaCl-Konzentration konstant.

Ausblühungen
Bei einer relativen Luftfeuchtigkeit unterhalb von 50% ist die Beziehung zwischen IAV-Zerfallsraten und NaCl- Konzentrationen nicht länger gültig. NaCl erreicht seine Löslichkeit in einem Tröpfchen (310 g/L) bei 75% r. F., und Verdampfung erzeugt eine übersättigte Lösung bei r. F. < 75%. Die NaCl-Konzentration kann auf bis zu 580 g/L ansteigen, bevor das Tröpfchen kristallisiert [25,26]. Die kritische relative Feuchte, bei der ein Tröpfchen kristallisiert, wird als Effloreszenz RH (ERH) bezeichnet und hängt von der Zusammensetzung und Größe des Tröpfchens ab [27].
Abbildung 3: Kristalle der vier Medien: (A) PBS, (B) PBS + FCS, (C) DMEM,
(D) DMEM + FCS. Lichtmikroskop, 100fach vergrößert; Maßstabsbalken = 20 μm.
Wir beobachteten die Tröpfchen jedes Mediums unter einem Mikroskop unmittelbar nach der Inkubation bei verschiedenen relativen Luftfeuchtigkeiten und stellten fest, dass sich bei r. F. >60% keine Kristalle bildeten, während Tröpfchen aller Medien bei einer r. F. knapp unter 50% kristal-lisierten (Abbildung 3). Die Kristallisation erfolgte innerhalb von zehn Minuten. Kristallisation in DMEM, möglicherweise bei einer niedrigeren NaCl-Konzentration (entsprechend höherer r. F.) als in PBS, aufgrund einer anderen ERH der Medien, könnte die geringere Abnahmegeschwindigkeit in DMEM bei einer Konzentration von 510 g/L (50% r. F.) erklären. Die ERH jedes Mediums zu kennen, würde diese Idee weiter untermauern, aber die ERH einer Lösung ist schwierig zu berechnen und kann nur durch spezialisierte Laborexperimente genau gemessen werden [27].



Abbildung 4. Hypothetische Beziehung zwischen relativer Luftfeuchtigkeit und der Lebensfähigkeit des IAV in (A) Tröpfchen,
die nur Salze enthalten, und (B) Tröpfchen, die Salze und Proteine enthalten.
Diskussion
Hypothese zur Erklärung der Beziehung zwischen r. F. und Lebensfähigkeit in Laborstudien
Wir postulieren, dass es drei Regime gibt, die die Lebensfähigkeit von IAV in Tröpfchen bestimmen, definiert durch Umgebungs-Luftfeuchte und gezeigt in Abb. 4: (1) physiologische Bedingungen (~99 bis 100% r. F.), bei denen die Konzentrationen gelöster Stoffe für die IAV harmlos sind und die Lebensfähigkeit erhalten bleibt, (2) konzentrierte Bedingungen (50 bis 99% r. F.), wobei die Verdampfung zu erhöhten Salzkonzentrationen führt, die für das Virus schädlich sein können, und (3) trockenen Bedingungen ( < 50% r. F.), wo die gelösten Stoffe kristallisieren, alles Wasser verloren ist und die Lebensfähigkeit der IAV erhalten bleibt.

In einem Salztröpfchen sind die erhöhten Salzkonzentrationen, die aus der Verdampfung resultieren, wahrscheinlich toxisch für das Virus, aber solche schädlichen Wirkungen würden eliminiert, wenn die Lösung kristallisiert. Daher würde die minimale Lebensfähigkeit bei einer relativen Luftfeuchtigkeit knapp über der relativen Luftfeuchtigkeit der im Tröpfchen enthaltenen Salze erwartet, wenn noch Wasser vorhanden ist und die Konzentrationen der gelösten Stoffe maximal sind. Die Beziehung zwischen relativer Luftfeuchtigkeit und der IAV-Lebensfähigkeit in einem Salztröpfchen wäre daher ähnlich zu der in Abb. 4A gezeigten. Das Vorhandensein von Proteinen im Tröpfchen kann diese Beziehung jedoch verändern.

Es ist möglich, dass die Wechselwirkung zwischen Proteinen, Salzen und dem Virus die nachteiligen Wirkungen von Salzen unter konzentrierten Bedingungen mildert. Daher würde das Virus eine hohe Lebensfähigkeit unter physiologischen und trockenen Bedingungen und eine mäßige Lebensfähigkeit unter konzentrierten Bedingungen in einem Tröpfchen, bestehend sowohl aus Salzen als auch aus Proteinen, aufrechterhalten (4B). Tatsächlich kann die Lebensfähigkeit mit abnehmender r. F. zunehmen, wie wir es bei DMEM + FCS und Schleim fanden, möglicherweise aufgrund des Schutzes durch Proteine bei erhöhten Konzentrationen [28, 29].

Eine Studie zum Langat-Virus unterstützt unsere Hypothese. Benbough [30] berichtete ähnliche V-förmige Kurven der Lebensfähigkeit gegenüber r. F. für Langat-Virus in Aerosolen, die aus Salzlösungen bestehen. Von den vier getesteten relativen Feuchten (d.h. ~25%, 50%, 70% und 95%) betrugen die minimalen Lebensfähigkeiten ~1% in NaCl und ~10% in KCl, beide bei ~50% r. F. und Null in LiCl bei r. F. < 50%. Somit trat die minimale Lebensfähigkeit des Langat-Virus in Aerosolen, die aus einer NaCl-Lösung bestanden, bei einer relativen Feuchtigkeit nahe der ERH von NaCl auf (d. H. 43±3%) [27]. KCl hat eine ERH von 59% [27], und diese r. F. wurde nicht getestet, daher ist nicht bekannt, ob die Lebensfähigkeit des Virus bei dieser r. F. niedriger gewesen wäre. Das ERH von LiCl liegt, wenn es existiert, außerhalb des Bereichs der getesteten relativen Feuchten; die relative Luftfeuchtigkeit in der Auflösung beträgt ~11% [24].

Erklärung für widersprüchliche Ergebnisse in der Literatur
Bei der Durchsicht der vier oben genannten Studien (H & H versus S & S) stellten wir fest, dass sich die Medien, die zur Herstellung von luftgetragenen Tröpfchen mit IAV verwendet wurden, unterschieden. Alle Medien enthielten einige Salze; die in H & H enthielten jedoch wesentlich mehr Proteine als diejenigen in S & S. Wir vermuten daher, dass die widersprüchlichen Ergebnisse zwischen S & S und H & H auf den unterschiedlichen Proteingehalt der in diesen Studien verwendeten Medien zurückzuführen sind. Unsere Ergebnisse mit Modellmedien bestätigen diese Hypothese: Die Trends in der Lebensfähigkeit gegenüber relativer Feuchte in Medien mit hauptsächlich Salzen (S & S und diese Studie) ähneln der Darstellung in 4A, während diejenigen in Medien mit Salzen und Proteinen (H & H und diese Studie) ähnlich Abbildung 4B sind.

Abbildung 2. Viruszerfall über 3 Stunden gegenüber der NaCl-Konzentration in Tröpfchen, die aus vier Medientypen bestehen. Abbildung 3. Kristalle der vier Medien: (A) PBS, (B) PBS + FCS, (C) DMEM, (D) DMEM + FCS. Lichtmikroskop, 100fach vergrößert; Maßstabsbalken = 20 μm. Abbildung 4. Hypothetische Beziehung zwischen relativer Luftfeuchtigkeit und der Lebensfähigkeit des IAV in (A) Tröpfchen, die nur Salze enthalten, und (B) Tröpfchen, die Salze und Proteine enthalten.

Wir haben gezeigt, dass der Zerfall von Viren mit der Salzkonzentration in Salztröpfchen korreliert, die durch Verdunstung durch relative Luftfeuchtigkeit gesteuert wird (Abbildung 2). Frühere Studien, die auf Experimenten in Massensalzlösungen bei Konzentrationen bis zur Sättigung basieren, konnten eine solche Korrelation nicht nachweisen [31]. Die übersättigten Bedingungen, denen das Virus in Aerosolen ausgesetzt ist, können in Massenmedien nicht erreicht werden, und so kann das hier beobachtete Phänomen nur durch Methoden gezeigt werden, die eine Übersättigung ermöglichen. Die Kombination von stark erhöhten Salzkonzentrationen bei mittlerer relativer Luftfeuchtigkeit und Salzkristallisation am ERH kann die beobachteten Trends in den beiden Medien, die hauptsächlich Salze (d. H. PBS und DMEM) enthalten, und in S&S erklären.

Die relative Feuchte, die der maximalen Abklingrate entspricht, kann sich zwischen den Medien unterscheiden, möglicherweise aufgrund unterschiedlicher ERHs für Medien unterschiedlicher Zusammensetzung [27]. Die minimalen Lebensfähigkeiten lagen zwischen 40-70% r. F., hauptsächlich bei etwa 50% in Schaffer et al. [14] und 58-60% in Shechmeister. [15] Zum Vergleich fanden wir eine Mindestlebensfähigkeit von 50% in PBS und 60% in DMEM.

Wie H&H fanden wir, dass Proteine eine schützende Wirkung für IAV unter konzentrierten Bedingungen bei mittlerer r. F. hatten, obwohl die Gründe dafür noch unbekannt sind. Eine Möglichkeit besteht darin, dass sich Proteine in Aerosoltröpfchen durch gegenseitige Hydrophobie um Viren herum anreichern können und einen gewissen Schutz gegen konzentrierte Salze bieten. Obwohl diese Hypothese sehr spekulativ ist, wird sie durch die Tatsache gestützt, dass Mucin-Glykoproteine normalerweise als Barrikade gegen potentielle Pathogene, einschließlich Viren und Bakterien, durch spezifische oder unspezifische Bindung dienen [28, 29].

Beziehung in Schleim
Schleim des Atemtrakts ist eine komplizierte Kombination von Wasser (95%), anorganischen Salzen (1%) und verschiedenen makromolekularen organischen Verbindungen einschließlich Glykoproteinen (d. H. Muzinen) und Lipiden [20, 21, 32]. Es wurde gezeigt, dass es IAV bei niedriger r. F. schützt [33, 34]. Die Beziehung zwischen der Lebensfähigkeit von IAV in Schleim und relativer Feuchtigkeit ist jedoch noch nicht vollständig klar. Wir führten zunächst Experimente mit Muzin-Extrakten aus Schweinemagen durch (Typ II, Sigma-Aldrich). Die Ergebnisse zeigten, dass die IAV-Infektion blockiert war, wahrscheinlich durch die gebundene Sialinsäure auf dem Mucin. In ähnlicher Weise könnten Glykane auf menschlichem Schleim die IAV-Anheftung an die Zelle in dem TCID50-Assay verhindern. Ein solcher Effekt war jedoch gemäß unserem Experiment nicht signifikant. Der Titer von IAV, der in die Humanschleimprobe gespickt wurde, war 5,1±2,6x107 TCID50 ml-1, nachdem er für zwei Stunden auf Eis gehalten wurde, mit einem Spitzentiter von 1,78x108 TCID50 ml-1. Darüber hinaus sollten die Ergebnisse der Berichterstattung in Schleimproben als das Verhältnis der nach Inkubation bei einer bestimmten relativen Luftfeuchtigkeit wiederhergestellten Lebensfähigkeit zur ursprünglichen Lebensfähigkeit, die beide im Schleim getestet wurden, die mögliche Blockierungswirkung von Glykanen auf den Schleim überprüfen. Daher spiegeln die hier berichteten Ergebnisse die Wirkung von relativer Luftfeuchtigkeit wider.

In Übereinstimmung mit der Literatur [33,34] fanden wir höhere Lebensfähigkeiten bei niedrigen relativen Luftfeuchtigkeiten (< 50%). Der Befund, dass IAV am besten bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit überlebte, ein Zustand, der zuvor nicht untersucht wurde, trägt dazu bei, das Verständnis der Reaktion des Virus auf variierende r. F. zu vervollständigen.

Die Beziehung in Schleim hat eine gewisse Ähnlichkeit mit der in Medien mit Salzen und Proteinen, insbesondere DMEM + FCS (d.h. höhere Lebensfähigkeiten bei 100% r. F. oder r. F. < 50% und viel Niedrigere bei mittlerer r. F. im Bereich von 50% bis 84%). Jedoch war die Lebensfähigkeit gegenüber Luftfeuchtigkeit im Schleim viel empfindlicher als in synthetischen Modellmedien. Eine geringe Änderung der relativen Luftfeuchtigkeit von 48% auf 52% verringerte die Lebensfähigkeit um das 10-fache und die Lebensfähigkeit bei einer relativen Feuchtigkeit von 84% war >500-mal niedriger als bei einer relativen Feuchtigkeit von 48%. Zum Vergleich variierten in den Modellmedien die Lebensfähigkeiten nur um eine Größenordnung im selben Feuchte-Bereich, was mit früheren Studien übereinstimmt [8, 13]. Daher könnte r. F. eine größere Wirkung auf das Überleben von IAV in Schleim haben, als in früheren Studien mit synthetischen Medien gezeigt wurde. Diese Ergebnisse unterstreichen den möglichen Einfluss von relativer Feuchte auf das Überleben des Virus in seinem natürlichen Aerosolträger während der Übertragung.

Implikationen für Influenza-Übertragungsmuster
Es wurden viele Mechanismen vorgeschlagen, um die Saisonabhängigkeit der Influenza zu erklären, darunter (1) Umwelt- und Klimafaktoren (z. B. Temperatur, relative oder absolute Luftfeuchtigkeit und Sonnenintensität), (2) Verhaltensänderungen des Wirts (z. B. Schulzeitplan und erhöhte Besucherzahlen im Winter oder zur Regenzeit) und (3) Schwankungen der Immunkompetenz des Wirts (z. B. Vitamin-D-Spiegel und Melatonin-Spiegel) [7,35]. Eine aktuelle Übersicht von Tamerius et al. [7] bewertet die Durchführbarkeit verschiedener Mechanismen und kommt zu dem Schluss, dass die zentralen Fragen der Influenza-Saisonalität ungelöst bleiben. Unsere Studie war auf den Einfluss von Feuchtigkeit ausgerichtet und wir führten alle Experimente bei Raumtemperatur durch. In Innenräumen, in denen eine Infektion aufgrund der viel längeren dort verbrachten Zeit und der größeren räumlichen Dichte potenzieller Wirte wahrscheinlicher ist, fällt die Temperatur tendenziell in einen engen Bereich um 20°C. Mit dieser Einschränkung waren wir nicht in der Lage, zwischen den Wirkungen der relativen und der absoluten Feuchtigkeit zu unterscheiden.

Unsere Ergebnisse im menschlichen Schleim könnten dazu beitragen, zumindest teilweise die Übertragungsmuster von Influenza zu erklären. In den gemäßigten Regionen verringert die Erwärmung im Winter die relative Luftfeuchtigkeit in Innenräumen auf niedrige Werte, in der Regel 40% [36,37]. Niedrige relative Luftfeuchtigkeit trägt nicht nur zur Erhaltung der Lebensfähigkeit von IAV bei, sondern ermöglicht auch, dass IAV-Trägeraerosole aufgrund ihrer geringeren Größe und geringeren Absetzgeschwindigkeiten, die aus einer stärkeren Verdampfung resultieren, länger in der Luft verbleiben [16]. So könnte die Übertragung von Influenza in gemäßigten Regionen im Winter vor allem über den Aerosol-Weg verstärkt werden. In tropischen Regionen können hohe Temperaturen die Übertragung insbesondere durch den Aerosol- Weg unterdrücken [38, 39]. Niedrigere Temperaturen und eine nahezu gesättigte Luftfeuchtigkeit während der Regenzeit bieten jedoch die Möglichkeit, große Tröpfchen oder sehr kleine Aerosole über verschiedene Mechanismen zu übertragen. Große Tröpfchen würden sich aufgrund der Gravitation schneller absetzen, da sie bei 100% relativer Feuchtigkeit nicht so stark schrumpfen (nur 93% ihrer ursprünglichen Durchmesser bei 99% r. F. und 76% bei 98% r. F. [16]). Sobald sie sich auf einer Oberfläche abgelagert haben, können sie als Reservoir für die Kontraktübertragung dienen [39,40], da IAV, wie in dieser Studie gezeigt, bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit gut konserviert ist. Auf der anderen Seite würden Submikron- Aerosole, wie sie im menschlichen Atem ausgeatmet werden [41], in der Luft bleiben, und dank der niedrigeren Temperaturen und geeigneter relativer Feuchten zum Überleben könnte die Übertragung durch diese Submikron-Tröpfchen über den Aerosol-Weg noch wirksam sein.

Einschränkung und Richtungen für die zukünftige Studie
In dieser Studie wurden Tröpfchen von 1 μL anstelle von kleineren Aerosolen [42] verwendet, um das Zusammenspiel von Feuchtigkeit, Tröpfchenverdampfung, Konzentrationen gelöster Stoffe im Tröpfchen und Viruslebensfähigkeit zu simulieren. Es dauert ~10 Minuten, bis solche Tröpfchen bei ~50% r. F. vollständig austrocknen, und zwar beträchtlich länger als bei viel kleineren Tröpfchen (z. B. < 1 s für ein Atemtröpfchen mit 20 μm Durchmesser [17]). Die Rechtmäßigkeit der Extrapolation unserer Ergebnisse auf Aerosole, die aus dem menschlichen Atemtrakt ausgestoßen werden, hängt daher davon ab, ob die Verdunstungsdynamik für den IAV-Zerfall kritisch ist. Unsere Ergebnisse in Modellmedien sind vergleichbar mit denen in Aerosolen [8,13]. Harper [13] gewann 1 s nach dem Versprühen, als die Verdampfung abgeschlossen war, 66–126% des IAV in Aerosolen zurück. Die hohen Wiederherstellungsraten zeigen, dass der Effekt des Verdampfungsprozesses selbst auf den Viruszerfall vernachlässigbar ist. Auch wenn dies kritisch war, wurde ein solcher Effekt beim Vergleich des Viruszerfalls in demselben Mediumtyp mit der relativen Luftfeuchtigkeit kontrolliert, da alle Tröpfchen eine ähnliche Verdunstungsrate aufwiesen. Die Überprüfung dieser Ergebnisse in Aerosolen ist jedoch gerechtfertigt.

Diese Studie schlägt eine neue mechanistische Grundlage für die Wirkung von relativer Luftfeuchte auf die Lebensfähigkeit von IAV in Tröpfchen vor. Es behandelt jedoch nicht den Mechanismus, durch den Salze die IAV-Lebensfähigkeit auf molekularer Ebene beeinflussen, noch erklärt es, wie die Anwesenheit von Proteinen die Beziehung verändert. Darüber hinaus unterschied sich die Beziehung in Schleim leicht von der in den Modellmedien beobachteten Beziehung. Angesichts der komplexen Zusammensetzung und der einzigartigen Beschaffenheit von Schleim können Mechanismen, die die Beziehung in Schleim steuern, von denen in Modellmedien abweichen.

Schlussfolgerungen
Diese Studie berichtet über neue Daten über die Reaktion von IAV in Tröpfchen von Modellmedien auf variierende relative Luftfeuchten, einschließlich extremer Bedingungen, die nie untersucht wurden, und zum ersten Mal die Beziehung zwischen der IAV Lebensfähigkeit in menschlichem Schleim und der Feuchtigkeit über einen großen Bereich von relativer Luftfeuchtigkeit. Die Ergebnisse legen nahe, dass es drei Regime der IAV-Lebensfähigkeit gibt, die durch relative Feuchte definiert sind. Wir liefern eine mechanistische Erklärung für diese Regimes, basierend auf der Tröpfchenverdampfung, einem nachfolgenden Anstieg der Konzentrationen von gelösten Stoffen in dem Tröpfchen und ihrer Wirkung auf das Virus. Unsere Theorie erklärt auch die widersprüchlichen Ergebnisse in der Literatur über die Lebensfähigkeit von IAV in Tröpfchen [8,13-15]. Wir skizzieren außerdem eine neue Perspektive auf die Abhängigkeit der IAV-Übertragung von der Luftfeuchtigkeit, die eine mögliche Erklärung für das saisonale Auftreten der Influenza in verschiedenen Regionen bietet.
Kommentar von
Dr. med. Walter J. Hugentobler


Diese Studie zeigte, dass das Influenza-A-Virus bei normalen Raumtemperaturen in Innenräumen bei niedriger Luftfeuchtigkeit gut überlebt. Seine Lebensfähigkeit nimmt schnell ab, wenn die relative Luftfeuchtigkeit gegen 50% ansteigt.

Die Autoren kamen zum Schluss, dass es die zunehmende Konzentration an gelösten Stoffen (Salzen) in den Tröpfchen war, durch die das Virus angegriffen wurde, solange die Salze in Lösung blieben. Sobald die Tröpfchen bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von unter 40% ausgetrocknet waren, kristallisierten die Salze aus und können das Virus nicht mehr inaktivieren, so dass es in dem nun trockenen Tröpfchen in der Luft überleben kann.

Die untersuchten Tröpfchen waren keine Tröpfchen in der Luft, sondern größere Tröpfchen, die auf Objektträgern austrocknen. Bisher konnte kein Forscher austrocknende Tröpfchen in der Luft beobachten. Interessanterweise war die absolute Anzahl lebensfähiger Viren im Schleim (im Vergleich zu den künstlichen Lösungen) zehnmal niedriger, aber Änderungen der Luftfeuchtigkeit hatten einen größeren Effekt!



Quellen


Originaltitel: Relationship between Humidity and Influenza A Viability in Droplets and Implications for Influenza’s Seasonality

Quellenlink: PLoS ONE 7(10): e46789

Veröffentlicht: 2012




1. Viboud C, Bjrnstad ON, Smith DL, Simonsen L, Miller MA, et al. (2006) Synchrony, waves, and spatial hierarchies in the spread of influenza. Science 312: 447–451.
2. Alonso WJ, Viboud C, Simonsen L, Hirano EW, Daufenbach LZ, et al. (2007) Seasonality of influenza in brazil: A traveling wave from the Amazon to the subtropics. Am J Epidemiol 165: 1434–1442.
3. Dosseh A, Ndiaye K, Spiegel A, Sagna M, Mathiot C (2000) Epidemiological and virological influenza survey in Dakar, Senegal: 1996–1998. Am J Trop Med Hyg 62: 639–643.
4. Shek LP, Lee BW (2003) Epidemiology and seasonality of respiratory tract virus infections in the tropics. Paediatr Respir Rev 4: 105–111.
5. Moura FE, Perdigao AC, Siqueira MM (2009) Seasonality of influenza in the tropics: A distinct pattern in northeastern brazil. Am J Trop Med Hyg 81: 180– 183.
6. Dushoff J, Plotkin JB, Levin SA, Earn DJD (2004) Dynamical resonance can account for seasonality of influenza epidemics. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16915–16916.
7. Tamerius J, Nelson M, Zhou S, Viboud C, Miller M, et al. (2011) Global influenza seasonality: Reconciling patterns across temperate and tropical regions. Environ Health Perspect 119: 439–445.
8. Hemmes JH, Winkler KC, Kool SM (1960) Virus survival as a seasonal factor in influenza and poliomyelitis. Nature 188: 430–431.
9. Shaman J, Kohn M (2009) Absolute humidity modulates influenza survival, transmission, and seasonality. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3243–3248.
10. Shaman J, Pitzer VE, Viboud C, Grenfell BT, Lipsitch M (2010) Absolute humidity and the seasonal onset of influenza in the continental United States. PLoS Biol 8: e1000316.
11. Soebiyanto RP, Adimi F, Kiang RK (2010) Modeling and predicting seasonal influenza transmission in warm regions using climatological parameters. PLoS ONE 5.
12. Tang JW, Lai FYL, Nymadawa P, Deng YM, Ratnamohan M, et al. (2010) Comparison of the incidence of influenza in relation to climate factors during 2000–2007 in five countries. J Med Virol 82: 1958–1965.
13. Harper GJ (1961) Airborne micro-organisms: Survival tests with four viruses. J Hyg 59: 479–486.
14. Schaffer FL, Soergel ME, Straube DC (1976) Survival of airborne influenza virus: Effects of propagating host, relative humidity, and composition of spray fluids. Arch Virol 51: 263–273.
15. Shechmeister IL (1950) Studies on the experimental epidemiology of respiratory infections: III. Certain aspects of the behavior of type a influenza virus as an airborne cloud. J Infect Dis 87: 128–132.
16. Yang W, Marr LC (2011) Dynamics of airborne influenza a viruses indoors and dependence on humidity. PLoS ONE 6: e21481.
17. Nicas M, Nazaroff WW, Hubbard A (2005) Toward understanding the risk of secondary airborne infection: Emission of respirable pathogens. J Occup Environ Hyg 2: 143–154.
18. Parienta D, Morawska L, Johnson GR, Ristovski ZD, Hargreaves M, et al. (2011) Theoretical analysis of the motion and evaporation of exhaled respiratory droplets of mixed composition. J Aerosol Sci 42: 1–10.
19. Brown JD, Goekjian G, Poulson R, Valeika S, Stallknecht DE (2009) Avian influenza virus in water: Infectivity is dependent on pH, salinity and temperature. Vet Microbiol 136: 20–26.
20. Effros RM, Hoagland KW, Bosbous M, Castillo D, Foss B, et al. (2002) Dilution of respiratory solutes in exhaled condensates. Am J Respir Crit Care Med 165: 663–669.
21. Raphael GD, Jeney EV, Baraniuk JN, Kim I, Meredith SD, et al. (1989) Pathophysiology of rhinitis. Lactoferrin and lysozyme in nasal secretions. J Clin Invest 84: 1528–1535.
22. Matrosovich M, Matrosovich T, Garten W, Klenk HD (2006) New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol J 3: 63.
23. Buckland FE, Tyrrell DaJ (1962) Loss of infectivity on drying various viruses. Nature 195: 1063–1064.
24. Greenspan L (1977) Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J Res Natl Bur Stand Sec A 81A: 89–96.
25. Cohen MD, Flagan RC, Seinfeld JH (1987) Studies of concentrated electrolyte solutions using the electrodynamic balance. 1. Water activities for singleelectrolyte solutions. J Phys Chem 91: 4563–4574.
26. Tang IN, Munkelwitz HR, Wang N (1986) Water activity measurements with single suspended droplets: The NaCl-H2O and KCl-H2O systems. J Colloid Interface Sci 114: 409–415.
27. Martin ST (2000) Phase transitions of aqueous atmospheric particles. Chem Rev 100: 3403–3454.
28. Mcguckin MA, Linde´n SK, Sutton P, Florin TH (2011) Mucin dynamics and enteric pathogens. Nat Rev Micro 9: 265–278.
29. Thornton DJ, Rousseau K, Mcguckin MA (2008) Structure and function of the polymeric mucins in airways mucus. Annu Rev Physiol 70: 459–486.
30. Benbough JE (1971) Some factors affecting the survival of airborne viruses. J Gen Virol 10: 209–220.
31. De Jong JC, Trouwborst T, Winkler KC (1973) The mechanism of virus decay in aerosols. In: Hers JFP, Winkler Kc, editor. Airborne transmission and airborne infection. New York-Toronto: John Wiley & Sons. 124–130.
32. Bansil R, Turner BS (2006) Mucin structure, aggregation, physiological functions and biomedical applications. Curr Opin Colloid Interface Sci 11: 164–170.
33. Parker ER, Dunham WB, Macneal WJ (1944) Resistance of the melbourne strain of influenza virus to desiccation. J Lab Clin Med 29: 37–42.
34. Thomas Y, Vogel G, Wunderli W, Suter P, Witschi M, et al. (2008) Survival of influenza virus on banknotes. Appl Environ Microbiol 74: 3002–3007.
35. Lofgren E, Fefferman NH, Naumov YN, Gorski J, Naumova EN (2007) Influenza seasonality: Underlying causes and modeling theories. J Virol 81: 5429–5436.
36. Engvall K, Wickman P, Norba¨ck D (2005) Sick building syndrome and perceived indoor environment in relation to energy saving by reduced ventilation flow during heating season: A 1 year intervention study in dwellings. Indoor Air 15: 120–126.
37. Yang W, Elankumaran S, Marr LC (2011) Concentrations and size distributions of airborne influenza a viruses measured indoors at a health centre, a day-care centre, and on aeroplanes. J R Soc Interface 8: 1176–1184.
38. Lowen AC, Mubareka S, Steel J, Palese P (2007) Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature. PLoS Pathog 3: e151.
39. Lowen AC, Steel J, Mubareka S, Palese P (2008) High temperature (30uC) blocks aerosol but not contact transmission of influenza virus. J Virol 82: 5650– 5652.
40. Lowen A, Palese P (2009) Transmission of influenza virus in temperate zones is predominantly by aerosol, in the tropics by contact: A hypothesis. PLoS Curr 1: RRN1002.
41. Fabian P, Mcdevitt JJ, Dehaan WH, Fung ROP, Cowling BJ, et al. (2008) Influenza virus in human exhaled breath: An observational study. PLoS ONE 3: e2691.
42. Duguid JP (1946) The size and the duration of air-carriage of respiratory droplets and droplet-nuclei. J Hyg 44: 471–479.
43. Stewart ME, Terepka AR (1969) Transport functions of the chick chorioallantoic membrane. I. Normal histology and evidence for active electrolyte transport from the allantoic fluid, in vivo. Exp Cell Res 58: 93–106.
44. Mcilvaine TC (1921) A buffer solution for colorimetric comparison. J Biol Chem 49: 183–186.
45. Sigma-Aldrich (2012) Minimum essential medium eagle (MEM).